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本试剂盒可以准确简便地进行mRNA的表达分析，采用的SYBR qPCR Master Mix为荧光实时定量PCR和Two-Step荧光实时定量PCR设计的最优反应体系，并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因TERT引物，简化实验步骤和提高实验效率。Master Mix含有Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶、dNTPS、进行优化处理的PCR反应缓冲液以及SYBR Green染料。使用Hot Start Taq DNA聚合酶，为PCR反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性，能够检测低至10个拷贝的目的基因。

本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对细胞基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。只需加入样品DNA模板，反应即可进行。

端粒是真核生物染色体末端特殊的DNA-蛋白结构，含多个重复序列(5'-TTAGGG-3')，端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体，是由RNA和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶，其可以利用自身的RNA模板合成末端DNA，并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失，从而使细胞获得增殖能力。

端粒酶蛋白催化亚基(TERT或TRT)具有反转录酶的主要特征，其表达在正常细胞中受到抑制，研究表明，TERT或TRT的表达与端粒酶活性的表达一致，与端粒酶的活化程度密切相关。Wisman等在人卵巢癌中利用逆转录PCR检测hTERT的mRNA的表达，并采用TRAP法检测端粒酶活性，结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理，百奥莱博实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒通过检测TERT的mRNA表达水平来间接反应端粒酶的活性。

组分	20T	50T
2×Maxima SYBR qPCR Mix	250μL	700μL
Nuclease-free Water	1.3mL	1.8mL
GAPDH-F Primer(1OD)	1支	1支
GAPDH-R Primer(1OD)	1支	1支
TERT-F Primer(1OD)	1支	1支
TERT-R Primer(1OD)	1支	1支

保存：-20℃，避光，有效期1年。


为确保引物的稳定性，本品以干粉的形式提供，规格为1OD。临用前，请将每支引物分别用25μL Nuclease-free Water或自备的DEPC水溶解成100μM的储液。然后根据实验需要，取适量100μM储液稀释成10μM的工作液，再取适量稀释后引物加入到反应体系中。100μM引物储液置于- 20℃至少保存6个月。


适应于大多数的Real-time PCR扩增仪，包括Applied Biosystems，Eppendorf，Corbett，Bio-Rad，Roche，杭州博日(Line-GeneBioer)等品牌的PCR扩增仪。

1. 模板
   
   1. DNA：25μL的Maxima SYBR Green实验体系中的基因组以及质粒DNA浓度最多为500ng。
      
   2. RNA：实时定量PCR体系中的RNA模板要求RNA模板没有基因组DNA的污染，我们建议使用DNase I来消除痕量的基因组DNA的污染；在实验体系中，最多5μg的总RNA用于cDNA的反转录合成，经反转录完毕后的cDNA模板总体系不应该超过实时定量PCR总体系的10%。
2. 必要的实验控制
   
   1. 阴性对照(NTC)：No template control反应是加入除模板DNA以外所有成分的阴性对照，可以避免或检测试剂中是否存在基因组DNA的污染、引物二聚体的产生。
      
   2. 阴性对照(RT Minus)：Reverse Transcriptase Minus control反应是指加入除逆转录酶制剂以外的全部组分，可以来检测RNA样本中是否含有基因组DNA的污染。

1. 操作步骤：
   
   1. 提取样本RNA，并进行逆转录获得cDNA。
      注：百奥莱博可提供总RNA提取试剂(Trizol法，货号：KFS435)
      
   2. 试剂溶解后，轻轻混匀并低速离心。
      
   3. 进行25μL体系的实时定量PCR请参考以下表格(DNA模板下一步中添加)：
      

      成分	用量
      2×Maxima SYBR qPCR Mix	12.5μL
      TERT-F/TERT-R Primer(10μM)	0.6～0.8μM
      GAPDH-F/GAPDH-R Primer(10μM)	0.6～0.8μM
      Template DNA	﹤500ng
      Nuclease-free Water	至25μL

      注：
      ① 体系中含有的MgCl₂终浓度为2.5mM。
      ② 大多数体系中引物终浓度为0.3μM可得到好的实验结果，如有调整，建议引物的终浓度范围在0.05～0.9μM。
      ③ 体系特殊要求，可以按照该体系进行调整。
      
   4. 将以上各组分(除DNA模板外)添加并混匀，加入至PCR反应管或反应板中。
      
   5. 添加DNA模板(≦500ng/反应)到第3步骤中准备好的PCR反应管或PCR板中。
      注：在两步法实时定量PCR中，加入的cDNA模板的体积不能超过反应总体积的10%。
      
   6. 轻轻的混匀PCR管中的各组分，避免产生气泡，如需要，可进行低速离心。如果有气泡的存在会影响荧光强度的收集。
      
   7. 参照一下说明设置实时定量PCR循环仪，放入样品并启动程序。(如有需要，可以根据仪器本身特点进行调整)
2. 循环参数设置：
   循环反应可以采用三步法或两步法进行实验，参考数据如下：
   
   1. 三步法循环参数设置：
      

      阶段	温度	时间	循环数
      (可选)UDG预处理	50℃	2min	1
      总变性	95℃	10min	1
      变性	95℃	15s	40
      复性	60℃	30s
      延伸	72℃	30s

      注：荧光信号的收集和处理是在延伸阶段。
      
   2. 两步法循环参数设置
      

      阶段	温度	时间	循环数
      (可选)UDG预处理	50℃	2min	1
      总变性	95℃	10min	1
      变性	95℃	15s	40
      复性/延伸	60℃	60s

3. 可选步骤：
   
   1. UDG预处理：如需减少PCR产物的污染，可以于总变性前用UDG预处理2min。
      
   2. 熔解曲线分析：可用于验证引物设计的特异性以及鉴定PCR产物。如果引物设计不够优化，可能会产生部分的引物二聚体，这些引物二聚体可以通过熔解曲线观测到。
4. 备注：
   
   1. 建议采用25μL的实验体系，如果改变请参照其余说明进行调整。
      
   2. 2×Maxima SYBR qPCR Mix含有除模板、引物外的全部组分，避免其反复冻融和污染是进行一个成功实时定量PCR反应的重要步骤。
      
   3. PCR扩增仪设定时需要建立起始5分钟，95℃的变性程序，以激活Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase。
      
   4. 一般实时定量实验中采用适宜体系确保2×Maxima SYBR qPCR Mix的最小化，避免产生大量的荧光强度。
      
   5. 针对不同实验条件和仪器型号重新调整荧光阈值。
      
   6. 当使用Bio-Rad的iCycler iQ或MyiQ system时请按照仪器生产商的说明进行实验。

问题	可能原因以及解决方案
没有扩增曲线或琼脂糖电泳检测不到目的条带	RNase污染 重新提取纯化RNA，分离无污染，高质量的RNA； 提取RNA的材料要尽量新鲜，防止RNA降解； 逆转录反应前，在变性胶上分析RNA的完整性； 有多聚糖的污染，用氯化锂的方法去除多聚糖。 RNA中包含逆转录反应的抑制剂 在提取RNA的过程中带有逆转录反应的抑制剂，通过70％乙醇对RNA沉淀进行清洗，除去抑制剂。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐等。 目标mRNA含有较强的转录中止子 逆转录反应可用随机引物代替Oligo dT，适当提高逆转录反应的温度。 起始RNA量较少 增加RNA的量。对于小于50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg～0.5μg乙酰BSA。 目的序列在分析的组织中不表达 尝试其他组织。 PCR反应中加入的逆转录产物过量 PCR反应中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的10%。 引物发生降解 对引物降解进行分析。 加样错误或者没有添加某一组分 重新进行实验，确认添加模板或引物的浓度； 确认试剂存放的温度条件，注意加样完全。 UDG预处理的条件下，复性温度过低 进过UDG处理后，PCR反应的复性温度应该高于55℃，如果复性温度必须要低于55℃，建议采用Heat-labile UDG。
没有扩增曲线	实时荧光定量PCR仪器设置错误 检测仪器检测参数是否正确(荧光染料的选择，荧光检测参数的设置等)。 没有激活荧光检测装置 激活荧光检测装置，设置于复性/延伸阶段或者延伸阶段收集荧光信号。 PCR仪器错误 参考仪器说明书解决仪器问题。
扩增曲线混乱或琼脂糖电泳检测到非特异条带	基因特异性引物设计较差 重新设计合成引物，遵循用于扩增引物设计的同样原则。 RNA中有基因组DNA的污染 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA；设置没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 镁离子浓度太高 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 引物和模板的非特异性退火 避免引物3'端含有2～3个dG或dC； 在第一链合成中使用基因特异性引物，而不是随机引物或oligo(dT)； 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
无模板阴性对照获得扩增曲线或琼脂糖电泳检测到目的条带	1.试剂中存在DNA污染 参考常规消除DNA污染的方法对模板进行处理，更换新的PCR试剂。
PCR效率超过110%	扩增出非特异性产物 使用熔解曲线对PCR产物分析，鉴定PCR产物的特异性，重新纯化DNA模板
PCR效率低于90%	体系中存在PCR抑制剂 重新纯化DNA模板。 PCR反应条件不合适 确认试剂的存放条件，确认引物浓度。
扩增曲线不佳	DNA模板的浓度过大 建议25μL的反应体系中DNA的最大量为500ng。 模板质量较差 如果可能，提高DNA模板的质量。 添加的逆转录反应产物过量导致抑制作用 实时定量PCR中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的10%。
荧光强度不一致(重复性较差)	实时荧光定量PCR循环仪存在污染 根据仪器厂商说明清理仪器，减少影响实验的污染因素。 PCR循环仪校准较差 根据仪器厂商说明调整仪器。

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